PROTEINE G E IL LORO RUOLO - BERSAGLI DELLE PROTEINE G

PROTEINE G E IL LORO RUOLO

Si tratta di proteine-messaggere, ma sono state chiamate G a causa della loro interazione con i nucleotidi guaninici GTP e GDP. Consistono di 3 subunità: α, β, γ. I nucleotidi guaninici si legano alla subunità α, che è provvista di attività enzimatica, catalizzando la conversione del GTP in GDP. Le subunità β e γ rimangono associati a formare un complesso βγ. Tutte 3 le subunità sono ancorati alla membrana mediante la catena di un acido grasso, legata ad un residuo amminoacidico per mezzo di una reazione nota come PRENILAZIONE. Le proteine G possono diffondere liberamente nel piano della membrana, conseguentemente le proteine G di una cellula possono interagire con recettori ed effettori diversi in maniera eterogenea e questo è importante per la loro funzione.

Allo stato di riposo, la proteina G si trova sotto forma di trimero αβγ slegato da qualsiasi recettore e con le GDP sulla subunità α. Quando 1 molecola di agonista occupa il recettore, si verifica una variazione conformazionale che determina il rilascio del GDP sostituito con GTP che attiva la subunità α la quale si dissocia e diffonde nella membrana e può legarsi ad enzimi e/o a canali ionici, causandone a seconda dei casi l’attivazione o la inattivazione. Il processo termina quando il GTP viene idrolizzato a GDP per l’attività GTPasica intrinseca della subunità α  la quale si dissocia dall’effettore e si ricombina con βγ completando in tal modo il ciclo.

Generalmente un singolo complesso recettore-agonista può attivare molte proteine G per volta e ognuna di queste porta alla formazione di un 2° messaggero con conseguente AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE.

La SPECIFICITÀ per un tipo di effettore dipende dal tipo di proteina G, distinto in 3 classi principali (G_S, G_i, G_q). Le proteine G_s e G_i producono rispettivamente stimolazione e inibizione dell’enzima Adenilato Ciclasi, mentre la G_q opera sulla fosfolipasi C e A₂

BERSAGLI DELLE PROTEINE G

Il sistema Adenilato Ciclasi

La subunità α della G_s attiva l’adenilato ciclasi che aumenta la concentrazione di AMP, i nucleotidi sintetizzati all’interno delle cellule a partire di ATP che è un 2° messaggero e va ad attivare altre proteine chinasi (PKA) AMP dipendenti, enzimi che catalizzano la fosforilazione di residui di serina o treonina in altre proteine cellulari attivandole  a loro volta àtrasduzione del segnale è determinando le molteplici funzioni cellulari:

Viene prodotto continuamente e inattivato per idrolisi da parte di una fosfodiesterasi, enzima inibito da molti farmaci. La subunità a della Gi inibisce l’adenilato ciclasi e diminuisce la concentrazione di cAMP.

Il sistema fosfolipasi C e A₂

La subunità a della G_q attiva la fosfolipasi C che scinde un fosfolipide di membrana, fosfatidilinositolo-4,5-difosfato,

liberando IP₃ e DAG come 2i messaggeri. L’IP₃  lega i canali del Ca²⁺ sul RE provocandone l’apertura e aumenta da concentrazione del Ca²⁺, il DAG invece è lipofilo e resta intrappolato nella membrana, là insieme al calcio attiva una proteina chinasi (PKC) calcio-dipendente, regolando in tal modo la fosforilazione di residui di serina e treonina di altre proteine intracellulari importanti per la trascrizione genica, aumenta la secrezione di molecole segnale e interferiscono sulla proliferazione cellulare responsabili delle manifestazioni tumorali. L’attivazione della fosfolipasi A₂ scinde un altro fosfolipide, la fosfatidilcolina, attaccando l’acido grasso in posizione 2 e liberando l’acido arachidonico da cui dipende la sintesi di prostaglandine, trombossani e leucotrieni, potenti mediatori dell’infiammazione e altre funzioni.

L’aumento dela concentrazione di Ca intracellulare induce molteplici risposte cellulari

·        -  Contrazione del muscolo liscio

·         - Aumento della forza di contrazione del muscolo cardiaco

·         - Secrezione da parte di ghiandole esocrine e rilascio di neurotrasmettitori

·         - Liberazione di ormoni

·         - Citotossicità

Gli effetti del Calcio dipendono dalla sua capacità di regolare varie proteine funzionali e enzimi, le proteine ontrattili e i canali ionici. Il legame di queste proteine col calcio può essere diretto o mediato da altre proteine, quali la CALMODULINA, una proteina citosolica ubiquitaria in grado di legare il Ca, che controlla una grande varietà di effettori.

Regolazione dei canali ionici

Le proteine G possono interagire direttamente con i canali modulandone l’apertura, aumentando la permeabilità al K⁺ che esce o entra, depolarizzando o iperpolarizzando la cellula senza implicare il coinvolgimento di 2i messaggeri.

Effetori controllati dalle proteine G Due sono le vie chiave controllate dai recettori attraverso l’interazione con le proteine G. Entrambe possono essere attivate o inibite dai ligandi, in funzione della natura del recettore e della proteina G. v  Adenilato ciclaci/cAMP: Ø  L’adenilato ciclasi catalizza la formazione del messaggero intracellulare cAMP. Ø  Il cAMP attiva varie proteine chinasi che controllano le funzioni cellulari in molti modi diversi causando la fosforilazione di diversi enzimi, trasportatori e altre proteine. v  Fosfolipasi C/inositolo trifosfato (IP3)/diacilglicerolo (DAG): Ø  Catalizza la formazione di due messaggeri intracellulari IP3 e DAG, dai fosfolipidi dimembrana Ø  IP3 agisce aumentando la C citosolica libera di calcio tramite il rilascio di Ca2+ dai compartimenti intracellulari Ø  L’aumento di calcio libero determina l’innescarsi di diversi eventi, fra cui la contrazione, la secrezione, l’attivazione di enzimi e l’iperpolarizzazione della membrana Ø  Il DAG attiva la proteina chinasi C, che, fosforilando diverse proteine, controlla molte funzioni cellulari. I recettori legati a proteine G controllano anche: v  La fosfolipasi A2 (e quindi la formazione di acido arachidonico e di eicosanoidi) v  I canali ionici (per esempio, i canali del calcio e del potassio, modificando di conseguenza l’eccitabilità di membrana, il rilascio di trasmettitori e la contrattilità).

FAMIGLIE DI RECETTORI: STRUTTURA E MECCANISMI DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE

In base alla struttura molecolare e al meccanismo di trasduzione, possiamo distinguere 4 TIPI di recettori o SUPERFAMIGLIE:

1.       RECETTORI LEGATI A CANALI: RECETTORI IONOTROPICI à recettori di membrana accoppiati direttamente a un canale ionico, sui quali agiscono i neurotrasmettitori veloci. Comprendono: 1) RECETTORI NICOTINICI dell’Ach, il RECETTORE DEL GABAa, il RECETTORE DEL Glu e 5HT3.

2.       RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINA G: RECETTORI METABOTROPICI à recettori di membrana accoppiati a sistemi effettori intracellulari per mezzo di proteine G sui quali agiscono ormoni e neurotrasmettitori lenti. Comprendono: i RECETTORI MUSCARINICI DELL’Ach e i RECETTORI ADRENERGICI.

3.       RECETTORI ACCOPPIATI A CHINASI: recettori di membrana che all'interno della loro struttura possiedono una porzione proteica tirosin-chinasi. Comprendono: i RECETTORI DELL’INSULINA, DELLE CITOCHINE e DEI FATTORI DI CRESCITA NEUROTROFICI, i RECETTORI PER L’ANF.

4.       RECETTORI NUCLEARI (recettori che regolano la trascrizione genica): RECETTORI PER GLI ORMONI STEROIDEI, per ORMONI TIROIDEI, per ACIDO RETINOICO e Vit-D.

RECETTORI-CANALI

STRUTTURA: IL RECETTORE NICOTINICO è il tipico rappresentante di questa famiglia. Consiste di 4 subunità, α-β-γ-δ, inserite nella membrana, che possiedono 2 siti di legame per l’Ach che devono essere entrambi occupati perché il recettore sia attivato. Ogni subunità attraversa la membrana 4 volte e sono organizzati a formare un poro. La porzione extracellulare N-terminale della subunità possiede residui zuccherini legati a particolari AA (GLICOSILAZIONE), il residuo N-terminale delle 2 subunità α contiene i siti di legame per l’Ach e una delle α-eliche transmembrana (M2) di ognuna delle 5 subunità forma la faccia interna del canale ionico e un residuo nell'elica M2 è il sito critico di controllo della selettività ionica del canale.

Altri recettori per trasmettitori di tipo veloce come recettore GABAa, recettori del Glu, e recettori 5-HT3 sono costituiti sullo stesso modello, pur essendo funzionalmente diversi.

MECCANISMO: implica un cambio di conformazione in seguito al legame con il ligando. I recettori di questo tipo controllano gli eventi sinaptici più veloci del SNC, nei quali un neurotrasmettitore agisce sulla membrana post-sinaptica di una cellula nervosa o muscolare. I neurotrasmettitori eccitatori, Ach a livello della giunzione neuromuscolare o il Glu nel SNC causano un aumento della permeabilità al Na⁺ e al K⁺, la cellula si depolarizza e scatta il PDA.

Canali ionici attivati da ligandi Ø  Anche definiti recettori ionotropici. Ø  Sono coinvolti prevalentemente nella trasmissione dei segnali sinaptici veloci. Ø  Ne esistono diverse famiglie con struttura diversa; la più comune è quella in cui si ha un assemblaggio eteromerico di 4-5 subunità, con eliche trasmembrana disposte intorno a un poro centrale. Ø  Il legame del ligando e l’apertura del canale si attuano in 1-2 millisecondi. Ø  Come esempio ci sono il recettore dell’acetilcolina di tipo nicotinico (nAChR), il recettore per il GABA di tipo A (GABAA) e il recettore della 5-idrossitriptamina ti tipo 3 (5-HT3).

RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINA G

La famiglia dei recettori accoppiati a proteina G comprende i RECETTORI MUSCARINICI dell’ADRENALINA, della DOPAMINA, della SEROTONINA, degli OPPIACEI, dei PEPTIDI, delle PURINE.

STRUTTURA: sono costituiti da un singolo polipeptide con una catena di 400-500 AA. Tutti possiedono 7-α eliche transmembrana con un dominio intracellulare che interagisce con le proteine intracellulari e un dominio extracellulare che interagisce con il segnale. La sequenza amminoacidica contiene nella coda C-terminale citoplasmatica alcuni residui di Ser e Treo che possono essere fosforilati da proteine chinasi specifiche mentre la porzione extracellulare è N-terminale.

MECCANISMO: l’attivazione avviene normalmente in seguito al legame di un agonista ma ci sono anche altri meccanismi alternativi, una conseguenza di ciò è che il recettore può essere attivato soltanto una volta. La inattivazione si instaura per mezzo di una DESENSIBILIZZAZIONE.

I residui di Ser e Treo nella coda C-terminale citoplasmatica funzionano come SITI DI FOSFORILAZIONE dove enzimi chinasi catalizzano l’accoppiamento di gruppi fosfato, dopo la quale il recettore viene internalizzato e degradato per poi essere rimpiazzato da proteine di nuova sintesi. In questo modo viene ridotta la capacità del recettore di interagire con le proteine G.

Recettori accoppiati alle proteine G Ø  Talvolta vengono chiamati recettori metabotropici. Ø  La struttura è costituita da sette α-eliche, spesso legate a formare strutture dimeriche. Ø  Uno dei loop intracellulare è più grande degli altri e interagisce con le proteine G. Ø  Le proteine G sono proteine di membrana costituite da 3 subunità α, β, γ. La subunità α ha attività GTPasica. Ø  Quando il trimero interagisce con il recettore occupato dal ligando, la subunità α si dissocia dal trimero ed è libera di attivare un effettore (un enzima di membrana o un canale ionico). In alcuni casi, le subunità βγ si comportano da attivatori. Ø  L’attivazione dell’effettore termina con l’idrolisi del GTP legato, ricomponendo così il trimero. Ø  Esistono diversi sottotipi di proteine G, che interagiscono con differenti recettori e controllano effettori diversi. Ø  Alcuni esempi includono i recettori colinergici muscarinici, i recettori adrenergici, i recettori per neuropeptidi e chemochine e recettori attivati da proteasi.

MECCANISMO D’AZIONE DEI FARMACI - BERSAGLIO DELL’AZIONE DEI FARMACI

 Le proteine bersagli dell’azione dei farmaci sulle cellule sono:

-          RECETTORI

Possono essere considerati i sensori nel sistema di comunicazione chimica, mentre i messaggeri chimici sono rappresentati dagli ormoni e dai neurotrasmettitori o altri mediatori.

-          CANALI IONICI

I canali ionici regolati da ligandi sono direttamente collegati ad un recettore, e si aprono solamente quando questo è occupato da un AGONISTA. In alcuni casi l’azione è indiretta coinvolgendo una proteina G. Inoltre il farmaco si lega direttamente a porzioni delle proteine del canale.

-          ENZIMI

Molto spesso la molecola di farmaco è un analogo del substrato dell’enzima e si comporta come “inibitore competitivo” dell’enzima stesso, reversibile e/o irreversibile. In altri casi il farmaco agisce quale “falso substrato” e in questo caso la sua molecola subisce una trasformazione chimica, formando un prodotto anormale che converte la normale via metabolica. Alcuni farmaci detti PROFARMACI, richiedono una degradazione enzimatica per essere convertiti da una forma inattiva a quella attiva.

-          TRASPORTATORI

Il trasporto di ioni e di piccole molecole organiche attraverso le membrane cellulari richiede un “carrier”, proteina trasportatrice, poiché sono molecole troppo polari o di grandi dimensioni. Queste contengono un sito di riconoscimento che le definisce la selettività per una determinata specie che sono dunque anche bersagli di molti farmaci il cui effetto è quello di bloccare il sistema di trasporto.

Bersagli dell’azione dei farmaci   Ø  Un farmaco è un composto chimico che influenza, in modo specifico, una funzione fisiologica.   Ø  Con qualche eccezione, i farmaci agiscono su bersagli di natura proteica: §   Recettori §   Enzimi §   Trasportatori §   Canali ionici   Ø  Il termine recettore è utilizzato in modi differenti. In farmacologia, descrive molecole proteiche la cui funzione è di riconoscere e rispondere a segnali chimici endogeni. Altre macromolecole con cui i farmaci interagiscono per produrre i loro effetti sono note come bersagli farmacologici.   Ø  La specificità è reciproca: singole classi i farmaci legano soltanto certi bersagli e, reciprocamente, singoli bersagli riconoscono solo certe classi di farmaci.   Ø  Nessun farmaco nell'esercitare la sua azione presenta una specificità assoluta. In diversi casi, l’aumento della dose di un farmaco determinerà la sua interazione con altri bersagli, diversi da quello principale. Ciò provoca l’insorgenza di effetti collaterali.

DESENSIBILIZZAZIONE E TACHIFILASSI

L’effetto di un farmaco diminuisce gradualmente quando viene somministrato continuamente o ripetutamente e questo si chiama DESENSIBILIZZAZIONE o TACHIFILASSI.

Per TOLLERANZA si intende la diminuzione più graduale della risposta ad un farmaco. La differenza tra i due termini non è così mostrata. Qualche volta si usa anche il termine REFRATTARIETÀ, perdita di efficacia terapeutica. La RESISTENZA ai farmaci è la perdita di efficacia degli antimicrobici. Questi fenomeni possono verificarsi grazie a:

-          MODIFICAZIONI RECETTORIALI (alterazione dei recettori): recettori accoppiati direttamente a canali ionici subiscono un lento cambiamento conformazionale determinando un forte legame tra la molecole dell’agonista col recettore, senza apertura del canale ionico.

-          TRASLOCAZIONE DEI RECETTORI (perdita dei recettori): graduale riduzione del numero dei recettori, succede che i recettori scomparsi vengono internalizzati dalla cellula con un meccanismo endocitotico.

-          ESAURIMENTO (o deplezione) DEI MEDIATORI: deplezione di un prodotto intermedio dalle vescicole dei terminali neuronali.

-          AUMENTO DELLA DEGRADAZIONE DEL FARMACO: Aumentata degradazione metabolica. Somministrazioni ripetute della stessa dose provocano una progressiva diminuzione delle concentrazioni plasmatiche.

-          ADATTAMENTO FISIOLOGICO: risposta di tipo omeostatico.

-          ESPULSIONE ATTIVA DEL FARMACO DALLA CELLULA

LEGAME DEI FARMACI ALLE CELLULE - ANTAGONISMO

Per produrre un effetto le molecole di farmaco devono essere legate a particolari costituenti cellulari e tissutali. La maggior parte produce i propri effetti legandosi a proteine.

4 categorie di pr. Regolatrici quali bersagli primari dei farmaci

1.       Enzimi

2.       Trasportatori

3.       Canali ionici

4.       Recettori

Un RECETTORE è qualsiasi molecola bersaglio con cui il farmaco si deve legare per provocare effetti specifici. Gli AGONISTI attivano i recettori mentre gli ANTAGONISTI possono legarsi allo stesso sito senza causare attivazione.

Il LIGANDO è una molecola piccola che può fungere da agonista o da antagonista.

SPECIFICITÀ DEI FARMACI

Per essere utile da un punto di vista terapeutico un farmaco deve agire selettivamente, cioè deve dimostrare un alto grado di SPECIFICITÀ per il LIGANDO. Nessun farmaco agisce con specificità completa. In genere, minore è la potenza di un farmaco, e maggiore è quindi la dose necessaria per determinare un certo effetto, più probabile è un coinvolgimento e l’attivazione di altri siti d’azione diversi da quello primario con comparsa di effetti indesiderati, dei quali nessun farmaco è privo.

CLASSIFICAZIONE DEI RECETTORI

Il principio di classificazione dei recettori è basato su criteri farmacologici. La suddivisione in sottotipi recettoriali per tutti i tipi di ligandi è responsabile degli effetti specifici dei farmaci.

INTERAZIONE FARMACO-RECETTORE

Il primo passo nell'azione dei farmaci sui recettori specifici è la formazione di un complesso reversibile farmaco-recettore

Farmaci AGONISTI: gli agonisti attivano il recettore quando lo occupano mentre gli antagonisti non determinano alcuna attivazione.

AGONISTI COMPLETI, l’effetto massimale è la prima risposta del tessuto in esame

CURVA Concentrazione-Effetto o DOSE-RISPOSTA. Risposta prodotta direttamente proporzionale all'occupazione recettoriale

AGONISTI PARZIALI: l’effetto massimo è una risposta inferiore.

Legame dei farmaci ai recettori   Ø  Il legame dei farmaci ai recettori è regolato dalla legge di interazione di massa.   Ø  All'equilibrio, l’occupazione del recettore è correlata alla C del farmaco attraverso l’equazione di Hill-Langmuir   Ø  Più è alta l’affinità del farmaco al recettore, più sarà bassa la C a cui il farmaco produrrà un dato effetto.   Ø  Gli stessi principi si applicano quando due o più farmaci competono per gli stessi recettori; ognuno ha l’effetto di ridurre l’affinità apparente degli altri.

EFFICACIA

Questo comportamento può essere espresso quantitativamente in termini di EFFICACIA, “forza” di un singolo complesso farmaco-recettore nel promuovere un risposta tissutale. Importanza delle caratteristiche del tessuto più caratteristiche del complesso farmaco-recettore è nell'insieme determinano l’ATTIVITÀ INTRINSECA del farmaco responsabile della risposta farmaceutica.

Il recettore può esistere in 2 stati: 1. A RIPOSO (R), 2. ATTIVATO (R*), ognuno dei quali può legare una molecola di farmaco. Uno spostamento dell’equilibrio tra questi 2 siti in favore di R* inizia la risposta. Quando non c’è nessun ligando l’equilibrio favorisce lo stato di riposo.

ANTAGONISMO TRA FARMACI

In farmacologia è frequente che l’effetto di un farmaco è ridotto o potenziato dalla presenza concomitante di un altro farmaco.

ANTAGONISMO CHIMICO: poco frequente. Due sostanze si combinano in soluzione, cosichè l’effetto del farmaco attivo viene annullato. (interazione in soluzione)

ANTAGONISMO FARMACOCINETICO: l’antagonista riduce efficacemente la concentrazione del farmaco attivo al sito d’azione. (un farmaco influenza l’assorbimeno, il metabolismo o l’eliminazione di un altro)

ANTAGONISMO PER BLOCCO DEL RECETTORE- ANTAGONISMO COMPETITIVO:

2 importanti meccanismi: (entrambi i farmaci si legano allo stesso recettore)

1.       Antagonismo competitivo reversibile: l’agonista può efficacemente spiazzare l’antagonista dal recettore

2.       Antagonismo competitivo irreversibile, quando l’antagonista si dissocia dai recettori molto lentamente o non si dissocia affatto, dunque se aggiunto l’agonista, non si verifica alcuna variazione occupazionale

ANTAGONISMO NON COMPETITIVO: l’antagonista blocca in un punto la catena di eventi che determinano la risposta recettoriale attivata dall'Agonista. (blocco dell’interazione recettore-effettore)

ANTAGONISMO FISIOLOGICO: interazione di 2 farmaci le cui azioni opposte sull'organismo tendono ad annullarsi reciprocamente.

Antagonismo competitivo    Ø  L’antagonismo competitivo reversibile è la forma di antagonismo più comune e importante; ha due caratteristiche principali: §   In presenza dell’antagonista, la curva logaritmica concentrazione-effetto dell’agonista è spostata verso destra senza cambiamenti della pendenza o dell’effetto massimo; la dimensione dello spostamento dipende dal rapporto dei dosaggi. §   Il rapporto dei dosaggi aumenta linearmente con la concentrazione dell’antagonista; la pendenza della curva è la misura dell’affinità dell’antagonista per il recettore.    Ø  L’affinità dell’antagonista, misurata in questo modo, è ampiamente utilizzata per la classificazione dei recettori. Agonisti, antagonisti ed efficacia   Ø  I farmaci che agiscono sui recettori possono essere agonisti o antagonisti.   Ø  Gli agonisti stimolano cambiamenti delle funzioni cellulari, generando effetti di vario tipo; gli antagonisti si legano ai recettori senza dare inizio ad alcun cambiamento.   Ø  La potenza dell’agonista dipende da due parametri: l’affinità (cioè la tendenza a legarsi ai recettori) e l’efficacia (cioè l’abilità, una volta legato, a promuovere modificazioni che portano all'effetto).   Ø  Per gli antagonisti l’efficacia è pari a zero.   Ø  Gli agonisti completi (cioè che producono l’effetto massimale) hanno alta efficacia; gli agonisti parziali (che producono un effetto submassimale) hanno efficacia intermedia.   Ø  In accordo con il modello a due stadi, l’efficacia riflette l’affinità relativa del composto per il recettore attivato e allo stato di riposo. Gli agonisti mostrano selettività per lo stato attivo; gli antagonisti non hanno selettività. Questo modello, benché possa essere di grande aiuto, non tiene in considerazione la complessità dell’azione dell’agonista.   Ø  Gli agonisti inversi mostrano selettività per lo stato a riposo del recettore; ciò può avere importanza solo nella situazione in cui i recettori siano costitutivamente attivi.