RECETTORI CHE REGOLANO LA TRASCRIZIONE DEL DNA

RECETTORI CHE REGOLANO LA TRASCRIZIONE DEL DNA

Sono recettori nucleari mediati da ORMONI STEROIDEI e TIROIDEI; i ligandi sono composti altamente lipofili in grado quindi di attraversare facilmente la membrana cellulare. Derivano tutti dallo stesso meccanismo di base, dalla stimolazione della trascrizione di geni selezionati, responsabili della sintesi di particolari proteine e dei relativi effetti. La struttura di base è costituita da grandi proteine monomeriche, costituite da 400-1000 AA contenenti una regione mediana delle molecole dove c’è il sito di legame al DNA (DNA-binding domain), esso contiene 2 anelli di circa 15 residui ciascuno, detti “dita per lo Zn” il cui forma consiste in un gruppo di residui di cisteina che circondano l’atomo di Zn che si avvolgono, si pensa, attorno all’elica del DNA. Inoltre è presente anche un dominio che regola la trascrizione e un dominio che regola l’inibizione. In assenza del segnale il recettore è inibito a livello del suo dominio inibitore. Quando arriva la molecola steroidea si lega  al recettore che di conseguenza cambia conformazione, l’inibitore si stacca e si attacca l’attivatore, esponendo il dominio che lega il DNA che è normalmente nascosto all’interno inducendo la trascrizione genica: attivazione di geni differenti e quindi sintesi di proteine completamente diverse. Altre molecole che agiscono in modo simile sono la Vit-D e l’acido retinoico, importante regolatore dello sviluppo embrionale durante la gravidanza.

CONTROLLO DELL’ESPRESSIONE DEI RECETTORI

Le proteine recettoriali vengono sintetizzate dalle cellule che le esprimono, e il livello di espressione è esso stesso soggetto a regolazione. A breve termine viene generalmente regolata attraverso processi di DESENSIBILIZZAZIONE. A lungo termine si manifesta attraverso l’aumento o la diminuzione dell’espressione dei recettori.

Recettori nucleari v  Una famiglia di 48 recettori solubili che percepisce segnali lipidici e ormonali e modula la trascrizione genica. v  Due principali gruppi: Ø  Sono presenti nel citoplasma, formano omodimeri in presenza dei loro partner e migrano nel nucleo. I loro ligandi sono prevalentemente di natura endocrina (per esempio, ormoni steroidei). Ø  Sono in genere costitutivamente presenti nel nucleo e formano eterodimeri con il recettore X dell’acido retinico. I loro ligandi sono abitualmente lipidi. v  Un terzo sottogruppo trasduce prevalentemente segnali endocrini ma funziona come eterodimero con il recettore X dei retinoidi (per esempio, l’ormone tiroideo). v  I complessi ligando-recettore determinano modificazioni della trascrizione genica attraverso il legame di elementi responsivi sul promotore genico e reclutando fattori coattivatori e corepressori v  Questa famiglia di recettori è responsabile degli effetti farmacologici di circa il 10% di tutti i farmaci prescritti, e gli enzimi da essa regolati influenzano la farmacocinetica di circa il 60% di tutti i farmaci prescritti.

SPECIFICITÀ DEGLI AGONISTI - RECETTORI ACCOPPIATI A TIROSIN-CHINASI E A GUANILATO CICLASI

SPECIFICITÀ DEGLI AGONISTI

La specificità di legame per una particolare proteina G dipende da una reazione della 3° piega intracellulare del recettore determinando una via di trasduzione rispetto all’altra in funzione del tipo di agonista che attiva il recettore. Tutti gli agonisti che interagiscono con uno specifico recettore producono lo stesso tipo di risposta cellulare.

RECETTORI ACCOPPIATI A TIROSIN-CHINASI E A GUANILATO CICLASI

I recettori accoppiati a tirosin-chinasi sono la 2° classe più importante di recettori di superficie. Mediano le azioni delle citochine e di vari ormoni quali l’insulina e dei fattori di crescita. La struttura di base consiste di un dominio intracellulare e un dominio extracellulare, contenenti ciascuno 400-700 residui AA. La regione intracellulare possiede attività Tirosin-chinasica e contiene sia siti che legano ATP sia altri siti per legare il substrato. Il legame del ligando al recettore provoca la dimerizzazione del recettore che attiva una cascata di chinasi. È presente soltanto una singola elica transmembrana, che collega il dominio esterno del recettore con il dominio interno. L’associazione di 2 domini intracellulari chinasici consente l’AUTOFOSFORILAZIONE dei residui di tirosina in questi due domini e questi residui autofosforilati servono poi come siti di legame per altre proteine intracellulari provviste di una specifica sequenza amminoacidica nota come “dominio sH₂”

MECCANISMI: le proteine contenenti il dominio sH₂ sono enzimi. Sono implicate nel controllo della divisione e della differenziazione cellulare e la loro principale azione è di stimolare la trascrizione di particolari sezioni del genoma.

Due vie nella trasduzione del segnale

1.       Via RAS/RAF

Media l’effetto di molti fattori di crescita e mitogeni. RAS è una proteina G monomerica che trasporta il segnale dalla proteina con dominio sH₂ (GBR) che viene fosforilata e attivata dal recettore tirosin-chinasico attivato dal ligando. L’attivazione di RAS a sua volta attiva RAF che è la prima protein-chinasi serina/treonina della cascata, la quale fosforila e attiva la successiva. L’ultima di queste è una MAP-chinasi che fosforila e attiva uno o più fattori di trascrizione che iniziano l’espressione genica. Dunque proteine RAS mutanti sono associate a molti tumori (legano il GTP ma non possono idrolizzarlo).

2.       Via JAK/STAT

Coinvolta nella risposta a molte CITOCHINE. Quando questi liganti legano il recettore inducono la dimerizzazione dello stesso, i dimeri si legano a proteine tirosin-chinasiche citosoliche (JAK) che si fosforilano tra di loro e vanno a fosforilare altre proteine tirosin-chinasiche (STAT) che sono proteine con domini sH₂ le quali si legano a livello di gruppi fosfotirosinici situati sui complessi recettore-JAK e vengono loro stesse fosforilate. Ciò fa dissociare il complesso liberando le STAT fosforilate che sono così attivate, dimerizzano e in questa forma raggiungono il nucleo dove interagiscono con il DNA e attivano l’espressione genica.

La guanilato ciclasi, enzima responsabile della formazione del 2° messaggero cGMP in risposta al legame con peptidi (AMP) è strutturalmente simile alla famiglia delle tirosin-chinasi piuttosto che a quella dell’adenilato ciclasi come invece si potrebbe pensare. È attivata in un modo simile attraverso la dimerizzazione quando l’agonista si lega.

N.B.

Le proteine G monomeriche omologamente alle proteine G eterotrimeriche operano mediante i cicli di attivazione (GTP) e inattivazione (GDP), ma si differenziano in quanto richiedono l’azione di ulteriori proteine regolatrici: la PLNC (proteina di liberazione dei nucleotidi guaninici) per l’attivazione e la PAG (proteina attivante le GTPasi) per l’inattivazione. Le RAS appartengono alle superfamiglia delle SWIG proteine intracellulari (proteine interruttore).

Recettori accoppiati a chinasi v  I recettori per i fattori di crescita hanno nel dominio intracellulare una tirosin-chinasi. v  I recettori per le citochine hanno un dominio intracellulare che, quando il recettore è attivato, lega e attiva chinasi citosoliche. v  Tutti i recettori condividono un’architettura comune, con un ampio dominio extracellulare che lega il ligando. Tale dominio è connesso attraverso un solo dominio transmembrana al dominio intracellulare. v  Generalmente la trasduzione del segnale coinvolge la dimerizzazione dei recettori, seguita da un’autofosforilazione dei residui di tirosina. I residui di fosfotirosina agiscono come accettori per i domini SH2 di diverse proteine intracellulari e controllano, di conseguenza, diverse funzioni cellulari. v  Sono coinvolti nella regolazione della crescita e del differenziamento cellulare e agiscono indirettamente sul controllo della trascrizione genica. v  Due importanti vie di trasduzione sono:      Ø  La via Ras/Raf/MAP chinasi, che è importante per la divisione, la crescita e il differenziamento cellulare      Ø  La via Jak/Stat attivata da diverse citochine, che controlla la sintesi e il rilascio di molti mediatori dell’infiammazione. v  Pochi recettori per gli ormoni (per esempio, quello per il fattore natriuretico atriale) hanno un’architettura simile e interagiscono con la guanilato ciclasi. Fosforilazione delle proteine nella trasduzione del segnale v  Diversi eventi controllati dai recettori coinvolgono la fosforilazione proteica, che regola la funzionalità e le proprietà di legame delle proteine intracellulari. v  I recettori tirosin-chinasici, quelli nucleotide-attivati tirosin-chinasici ciclici e quelli serina/treonina chinasi attivano una “cascata chinasica” che porta all'amplificazione del segnale. v  Ci sono molte chinasi, con differenti specificità di substrato, che conferiscono specificità alle vie attivate da diversi ormoni. v  La desensibilizzazione dei recettori accoppiati a proteine G è il risultato della fosforilazione da parte di specifici recettori chinasici. Ciò causa la perdita di funzionalità del recettore  e la sua internalizzazione. v  Esiste un’ampia famiglia di fosfatasi che agisce capovolgendo l’effetto delle chinasi.

PROTEINE G E IL LORO RUOLO - BERSAGLI DELLE PROTEINE G

PROTEINE G E IL LORO RUOLO

Si tratta di proteine-messaggere, ma sono state chiamate G a causa della loro interazione con i nucleotidi guaninici GTP e GDP. Consistono di 3 subunità: α, β, γ. I nucleotidi guaninici si legano alla subunità α, che è provvista di attività enzimatica, catalizzando la conversione del GTP in GDP. Le subunità β e γ rimangono associati a formare un complesso βγ. Tutte 3 le subunità sono ancorati alla membrana mediante la catena di un acido grasso, legata ad un residuo amminoacidico per mezzo di una reazione nota come PRENILAZIONE. Le proteine G possono diffondere liberamente nel piano della membrana, conseguentemente le proteine G di una cellula possono interagire con recettori ed effettori diversi in maniera eterogenea e questo è importante per la loro funzione.

Allo stato di riposo, la proteina G si trova sotto forma di trimero αβγ slegato da qualsiasi recettore e con le GDP sulla subunità α. Quando 1 molecola di agonista occupa il recettore, si verifica una variazione conformazionale che determina il rilascio del GDP sostituito con GTP che attiva la subunità α la quale si dissocia e diffonde nella membrana e può legarsi ad enzimi e/o a canali ionici, causandone a seconda dei casi l’attivazione o la inattivazione. Il processo termina quando il GTP viene idrolizzato a GDP per l’attività GTPasica intrinseca della subunità α  la quale si dissocia dall’effettore e si ricombina con βγ completando in tal modo il ciclo.

Generalmente un singolo complesso recettore-agonista può attivare molte proteine G per volta e ognuna di queste porta alla formazione di un 2° messaggero con conseguente AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE.

La SPECIFICITÀ per un tipo di effettore dipende dal tipo di proteina G, distinto in 3 classi principali (G_S, G_i, G_q). Le proteine G_s e G_i producono rispettivamente stimolazione e inibizione dell’enzima Adenilato Ciclasi, mentre la G_q opera sulla fosfolipasi C e A₂

BERSAGLI DELLE PROTEINE G

Il sistema Adenilato Ciclasi

La subunità α della G_s attiva l’adenilato ciclasi che aumenta la concentrazione di AMP, i nucleotidi sintetizzati all’interno delle cellule a partire di ATP che è un 2° messaggero e va ad attivare altre proteine chinasi (PKA) AMP dipendenti, enzimi che catalizzano la fosforilazione di residui di serina o treonina in altre proteine cellulari attivandole  a loro volta àtrasduzione del segnale è determinando le molteplici funzioni cellulari:

Viene prodotto continuamente e inattivato per idrolisi da parte di una fosfodiesterasi, enzima inibito da molti farmaci. La subunità a della Gi inibisce l’adenilato ciclasi e diminuisce la concentrazione di cAMP.

Il sistema fosfolipasi C e A₂

La subunità a della G_q attiva la fosfolipasi C che scinde un fosfolipide di membrana, fosfatidilinositolo-4,5-difosfato,

liberando IP₃ e DAG come 2i messaggeri. L’IP₃  lega i canali del Ca²⁺ sul RE provocandone l’apertura e aumenta da concentrazione del Ca²⁺, il DAG invece è lipofilo e resta intrappolato nella membrana, là insieme al calcio attiva una proteina chinasi (PKC) calcio-dipendente, regolando in tal modo la fosforilazione di residui di serina e treonina di altre proteine intracellulari importanti per la trascrizione genica, aumenta la secrezione di molecole segnale e interferiscono sulla proliferazione cellulare responsabili delle manifestazioni tumorali. L’attivazione della fosfolipasi A₂ scinde un altro fosfolipide, la fosfatidilcolina, attaccando l’acido grasso in posizione 2 e liberando l’acido arachidonico da cui dipende la sintesi di prostaglandine, trombossani e leucotrieni, potenti mediatori dell’infiammazione e altre funzioni.

L’aumento dela concentrazione di Ca intracellulare induce molteplici risposte cellulari

·        -  Contrazione del muscolo liscio

·         - Aumento della forza di contrazione del muscolo cardiaco

·         - Secrezione da parte di ghiandole esocrine e rilascio di neurotrasmettitori

·         - Liberazione di ormoni

·         - Citotossicità

Gli effetti del Calcio dipendono dalla sua capacità di regolare varie proteine funzionali e enzimi, le proteine ontrattili e i canali ionici. Il legame di queste proteine col calcio può essere diretto o mediato da altre proteine, quali la CALMODULINA, una proteina citosolica ubiquitaria in grado di legare il Ca, che controlla una grande varietà di effettori.

Regolazione dei canali ionici

Le proteine G possono interagire direttamente con i canali modulandone l’apertura, aumentando la permeabilità al K⁺ che esce o entra, depolarizzando o iperpolarizzando la cellula senza implicare il coinvolgimento di 2i messaggeri.

Effetori controllati dalle proteine G Due sono le vie chiave controllate dai recettori attraverso l’interazione con le proteine G. Entrambe possono essere attivate o inibite dai ligandi, in funzione della natura del recettore e della proteina G. v  Adenilato ciclaci/cAMP: Ø  L’adenilato ciclasi catalizza la formazione del messaggero intracellulare cAMP. Ø  Il cAMP attiva varie proteine chinasi che controllano le funzioni cellulari in molti modi diversi causando la fosforilazione di diversi enzimi, trasportatori e altre proteine. v  Fosfolipasi C/inositolo trifosfato (IP3)/diacilglicerolo (DAG): Ø  Catalizza la formazione di due messaggeri intracellulari IP3 e DAG, dai fosfolipidi dimembrana Ø  IP3 agisce aumentando la C citosolica libera di calcio tramite il rilascio di Ca2+ dai compartimenti intracellulari Ø  L’aumento di calcio libero determina l’innescarsi di diversi eventi, fra cui la contrazione, la secrezione, l’attivazione di enzimi e l’iperpolarizzazione della membrana Ø  Il DAG attiva la proteina chinasi C, che, fosforilando diverse proteine, controlla molte funzioni cellulari. I recettori legati a proteine G controllano anche: v  La fosfolipasi A2 (e quindi la formazione di acido arachidonico e di eicosanoidi) v  I canali ionici (per esempio, i canali del calcio e del potassio, modificando di conseguenza l’eccitabilità di membrana, il rilascio di trasmettitori e la contrattilità).

FAMIGLIE DI RECETTORI: STRUTTURA E MECCANISMI DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE

In base alla struttura molecolare e al meccanismo di trasduzione, possiamo distinguere 4 TIPI di recettori o SUPERFAMIGLIE:

1.       RECETTORI LEGATI A CANALI: RECETTORI IONOTROPICI à recettori di membrana accoppiati direttamente a un canale ionico, sui quali agiscono i neurotrasmettitori veloci. Comprendono: 1) RECETTORI NICOTINICI dell’Ach, il RECETTORE DEL GABAa, il RECETTORE DEL Glu e 5HT3.

2.       RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINA G: RECETTORI METABOTROPICI à recettori di membrana accoppiati a sistemi effettori intracellulari per mezzo di proteine G sui quali agiscono ormoni e neurotrasmettitori lenti. Comprendono: i RECETTORI MUSCARINICI DELL’Ach e i RECETTORI ADRENERGICI.

3.       RECETTORI ACCOPPIATI A CHINASI: recettori di membrana che all'interno della loro struttura possiedono una porzione proteica tirosin-chinasi. Comprendono: i RECETTORI DELL’INSULINA, DELLE CITOCHINE e DEI FATTORI DI CRESCITA NEUROTROFICI, i RECETTORI PER L’ANF.

4.       RECETTORI NUCLEARI (recettori che regolano la trascrizione genica): RECETTORI PER GLI ORMONI STEROIDEI, per ORMONI TIROIDEI, per ACIDO RETINOICO e Vit-D.

RECETTORI-CANALI

STRUTTURA: IL RECETTORE NICOTINICO è il tipico rappresentante di questa famiglia. Consiste di 4 subunità, α-β-γ-δ, inserite nella membrana, che possiedono 2 siti di legame per l’Ach che devono essere entrambi occupati perché il recettore sia attivato. Ogni subunità attraversa la membrana 4 volte e sono organizzati a formare un poro. La porzione extracellulare N-terminale della subunità possiede residui zuccherini legati a particolari AA (GLICOSILAZIONE), il residuo N-terminale delle 2 subunità α contiene i siti di legame per l’Ach e una delle α-eliche transmembrana (M2) di ognuna delle 5 subunità forma la faccia interna del canale ionico e un residuo nell'elica M2 è il sito critico di controllo della selettività ionica del canale.

Altri recettori per trasmettitori di tipo veloce come recettore GABAa, recettori del Glu, e recettori 5-HT3 sono costituiti sullo stesso modello, pur essendo funzionalmente diversi.

MECCANISMO: implica un cambio di conformazione in seguito al legame con il ligando. I recettori di questo tipo controllano gli eventi sinaptici più veloci del SNC, nei quali un neurotrasmettitore agisce sulla membrana post-sinaptica di una cellula nervosa o muscolare. I neurotrasmettitori eccitatori, Ach a livello della giunzione neuromuscolare o il Glu nel SNC causano un aumento della permeabilità al Na⁺ e al K⁺, la cellula si depolarizza e scatta il PDA.

Canali ionici attivati da ligandi Ø  Anche definiti recettori ionotropici. Ø  Sono coinvolti prevalentemente nella trasmissione dei segnali sinaptici veloci. Ø  Ne esistono diverse famiglie con struttura diversa; la più comune è quella in cui si ha un assemblaggio eteromerico di 4-5 subunità, con eliche trasmembrana disposte intorno a un poro centrale. Ø  Il legame del ligando e l’apertura del canale si attuano in 1-2 millisecondi. Ø  Come esempio ci sono il recettore dell’acetilcolina di tipo nicotinico (nAChR), il recettore per il GABA di tipo A (GABAA) e il recettore della 5-idrossitriptamina ti tipo 3 (5-HT3).

RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINA G

La famiglia dei recettori accoppiati a proteina G comprende i RECETTORI MUSCARINICI dell’ADRENALINA, della DOPAMINA, della SEROTONINA, degli OPPIACEI, dei PEPTIDI, delle PURINE.

STRUTTURA: sono costituiti da un singolo polipeptide con una catena di 400-500 AA. Tutti possiedono 7-α eliche transmembrana con un dominio intracellulare che interagisce con le proteine intracellulari e un dominio extracellulare che interagisce con il segnale. La sequenza amminoacidica contiene nella coda C-terminale citoplasmatica alcuni residui di Ser e Treo che possono essere fosforilati da proteine chinasi specifiche mentre la porzione extracellulare è N-terminale.

MECCANISMO: l’attivazione avviene normalmente in seguito al legame di un agonista ma ci sono anche altri meccanismi alternativi, una conseguenza di ciò è che il recettore può essere attivato soltanto una volta. La inattivazione si instaura per mezzo di una DESENSIBILIZZAZIONE.

I residui di Ser e Treo nella coda C-terminale citoplasmatica funzionano come SITI DI FOSFORILAZIONE dove enzimi chinasi catalizzano l’accoppiamento di gruppi fosfato, dopo la quale il recettore viene internalizzato e degradato per poi essere rimpiazzato da proteine di nuova sintesi. In questo modo viene ridotta la capacità del recettore di interagire con le proteine G.

Recettori accoppiati alle proteine G Ø  Talvolta vengono chiamati recettori metabotropici. Ø  La struttura è costituita da sette α-eliche, spesso legate a formare strutture dimeriche. Ø  Uno dei loop intracellulare è più grande degli altri e interagisce con le proteine G. Ø  Le proteine G sono proteine di membrana costituite da 3 subunità α, β, γ. La subunità α ha attività GTPasica. Ø  Quando il trimero interagisce con il recettore occupato dal ligando, la subunità α si dissocia dal trimero ed è libera di attivare un effettore (un enzima di membrana o un canale ionico). In alcuni casi, le subunità βγ si comportano da attivatori. Ø  L’attivazione dell’effettore termina con l’idrolisi del GTP legato, ricomponendo così il trimero. Ø  Esistono diversi sottotipi di proteine G, che interagiscono con differenti recettori e controllano effettori diversi. Ø  Alcuni esempi includono i recettori colinergici muscarinici, i recettori adrenergici, i recettori per neuropeptidi e chemochine e recettori attivati da proteasi.

MECCANISMO D’AZIONE DEI FARMACI - BERSAGLIO DELL’AZIONE DEI FARMACI

 Le proteine bersagli dell’azione dei farmaci sulle cellule sono:

-          RECETTORI

Possono essere considerati i sensori nel sistema di comunicazione chimica, mentre i messaggeri chimici sono rappresentati dagli ormoni e dai neurotrasmettitori o altri mediatori.

-          CANALI IONICI

I canali ionici regolati da ligandi sono direttamente collegati ad un recettore, e si aprono solamente quando questo è occupato da un AGONISTA. In alcuni casi l’azione è indiretta coinvolgendo una proteina G. Inoltre il farmaco si lega direttamente a porzioni delle proteine del canale.

-          ENZIMI

Molto spesso la molecola di farmaco è un analogo del substrato dell’enzima e si comporta come “inibitore competitivo” dell’enzima stesso, reversibile e/o irreversibile. In altri casi il farmaco agisce quale “falso substrato” e in questo caso la sua molecola subisce una trasformazione chimica, formando un prodotto anormale che converte la normale via metabolica. Alcuni farmaci detti PROFARMACI, richiedono una degradazione enzimatica per essere convertiti da una forma inattiva a quella attiva.

-          TRASPORTATORI

Il trasporto di ioni e di piccole molecole organiche attraverso le membrane cellulari richiede un “carrier”, proteina trasportatrice, poiché sono molecole troppo polari o di grandi dimensioni. Queste contengono un sito di riconoscimento che le definisce la selettività per una determinata specie che sono dunque anche bersagli di molti farmaci il cui effetto è quello di bloccare il sistema di trasporto.

Bersagli dell’azione dei farmaci   Ø  Un farmaco è un composto chimico che influenza, in modo specifico, una funzione fisiologica.   Ø  Con qualche eccezione, i farmaci agiscono su bersagli di natura proteica: §   Recettori §   Enzimi §   Trasportatori §   Canali ionici   Ø  Il termine recettore è utilizzato in modi differenti. In farmacologia, descrive molecole proteiche la cui funzione è di riconoscere e rispondere a segnali chimici endogeni. Altre macromolecole con cui i farmaci interagiscono per produrre i loro effetti sono note come bersagli farmacologici.   Ø  La specificità è reciproca: singole classi i farmaci legano soltanto certi bersagli e, reciprocamente, singoli bersagli riconoscono solo certe classi di farmaci.   Ø  Nessun farmaco nell'esercitare la sua azione presenta una specificità assoluta. In diversi casi, l’aumento della dose di un farmaco determinerà la sua interazione con altri bersagli, diversi da quello principale. Ciò provoca l’insorgenza di effetti collaterali.